在《黑暗孢子》中，玩家会遭遇数百种不同敌人类型(和玩家的英雄一样，以相同五种基因类型为基础)，各类型敌人拥有独特能力与攻击样式。许多敌人的混合攻击招式，能令基因英雄倍感棘手，而每颗星球上都会居住着一名敌人头目，这些头目各自拥有不同的特殊攻击、强项与弱点。

某些敌人只会出现在合作游戏中，专为鼓励玩家发挥团队精神而设计，他们会定住英雄，使之无法使用能力或无法切换英雄。队员们必须同心协力、互相协助。

《黑暗孢子》的“AI 控制系统”(AI Director)拿游戏中变化无穷的敌人当积木使用，能结合不同敌人设定，变化敌人在关卡中出现的位置及数量，以及依据队伍中玩家人数与技巧来调整困难度，让玩家每次重玩关卡时都可享受到全新的体验。

敌人范例：

悬浮机械人(Hover Bots)：这些敌人会与其他同类联手，串接起雷射光束，伤害他们遇到的任何英雄。

酸壳兽(Acid Shell)：高能量抗性的生物基因敌人，肉搏英雄是对付他们的最佳利器。当酸壳兽的生命剩下一半时，它会缩回壳内，这时任何物理攻击都对它无效，并会放出毒云。

重力怪(Sink Hole)：会朝靠近的英雄发射重力投射物，在四周产生重力井将附近的英雄拉向它们。