《马里奥与路易RPG2》的故事仍然发生在大家熟悉的蘑菇王国,只不过时间有所不同。不知为何,马里奥与路易发现他们被传送到过去,并遇到了少年时代的马里奥与路易,4人同心协力(这也是日版取名2*2的原因)从神秘的异国力量的威胁下在一次拯救了蘑菇王国。
在游戏中现在的马里奥、路易与小马里奥、小路易4人将同时登场,并利用NDS的双屏,上屏幕显示小马里奥和小路易,而下屏幕显示马里奥与路易。游戏的整个过程中都要通过双方的巧妙配合才可以解开一个个谜题。而新角色大恐龙“盖西”(难道是耀西朋友?),总是处于饥饿状态,身形巨大的它一口就能将耀西吞进肚子里。 在前作中马里奥直接使用大锤进行攻击,而本作中由于身背小马里奥,所以就由小马里奥手持大锤,马里奥攻击时将小马里奥联同大锤一起对敌人进行攻击,这使攻击的威力比前作有所增强。同样由于身背小马里奥使得重量增加,所以本作中跳跃攻击的威力也比前作大的多。另外,在放下小马里奥后,马里奥可以对敌人进行连续的跳跃攻击。